Лекция № 2. строение и функции углеводов и липидов

Биохимические методы исследования

Биохим, определение Л. проводится гл. обр. в плазме или сыворотке крови, значительно реже в кале (с целью диагностики стеатореи) и моче (при липурии). Определение Л

в плазме крови особенно важно при заболеваниях, сопровождающихся повышением их концентрации в крови (гиперлипидемиях). К ним относятся некоторые заболевания печени (острые и хрон, гепатиты, цирроз и др.), липоидный нефроз (нефротическая гиперлипидемия), сахарный диабет, атеросклероз, панкреатиты, гипотиреоз

Широко применяется определение Л. (холестерина и триглицеридов) в крови при фенотипировании первичных и вторичных гиперлипопротеинемий с целью диагностики и рационального диетического и медикаментозного лечения. Снижение содержания Л. в крови (гиполипидемия) наблюдается реже — при длительном голодании или резко ограниченном потреблении жиров и при гипертиреозе.

При исследовании Л. в крови необходимо строго придерживаться следующих общих принципов: 1) взятие крови производится натощак спустя 10—12 час. после последнего приема пищи; 2) плазма (сыворотка) крови, используемая для анализа, не должна быть гемолизированной; 3) для экстрагирования Л. применяются органические растворители высокой степени очистки; 4) стандарты или референтные препараты Л. сопоставляют с международными стандартами и хранят в замороженном состоянии.

Существует несколько методов определения общих Л. в плазме (сыворотке) крови. Широкое применение нашли гравиметрические методы, основанные на экстрагировании Л. из плазмы крови смесью органических растворителей, с последующим их выпариванием и взвешиванием липидного остатка. Эти методы, однако, не отличаются высокой точностью.

Ряд методов основан на окислении общих Л. хромовой кислотой с последующим титриметрическим или колориметрическим количественным определением (см. Колориметрия, Титриметрический анализ). Широко применяется метод, основанный на цветной реакции, к-рую дают продукты распада Л. с сульфофосфованилиновым реактивом. Метод определения общих Л. в сыворотке крови с сульфофосфованилиновым реактивом принят у нас в стране в качестве унифицированного; содержание Л. в сыворотке крови здорового человека, определенное этим методом, в среднем составляет 350—800 мг%.

Концентрацию общих Л. в сыворотке крови определяют также методом Свана в модификации Л. К. Баумана (окрашенные судаковым черным Л. количественно извлекаются из сыворотки крови и определяются фотометрически) и турбидиметрическим методом (метод Хуэрго), в основу к-рого положено измерение оптической плотности жировой эмульсии, образуемой при взаимодействии серной к-ты с n-диоксановым экстрактом Л. сыворотки крови. Методом Хуэрго в сыворотке крови здорового человека определяется 500 — 700 мг% общих Л.

Для определения триглицеридов наиболее часто применяют методы, в основе которых лежит гидролитическое расщепление триглицеридов. Образовавшийся в результате гидролиза глицерин окисляют до формальдегида и последний определяют колориметрически. Наибольшей точностью из таких методов обладает метод Карлсона, часто применяемый в модификации Игнатовской (H. Ignatowsca).

Для определения холестерина используют методы, основанные на цветной реакции Либерманна— Бурхарда (см. Либерманна-Бурхарда реакция), причем наибольшей точностью из них обладает метод Абелля (см. Абелля метод). Кроме того, для определения холестерина и триглицеридов в крови начинают применять высокоспецифические энзиматические методы с использованием готовых наборов реактивов. Наконец, для определения этих Л. используют автоанализаторы — отечественный прибор АБМ-1, автоанализатор АА-2 фирмы «Техникой» и др. (см. Автоанализаторы).

Методы определения фосфолипидов основаны на экстрагировании или осаждении фосфолипидов из плазмы (сыворотки) крови, минерализации фосфолипидного фосфора, проведении цветной реакции на фосфор и колориметрическом измерении интенсивности окраски (см. Блура метод).

Для определения неэтерифицированных жирных к-т используют титриметрические и колориметрические методы. Из последних наиболее часто применяют методы, основанные на том, что жирные к-ты образуют с медью соли, которые в свою очередь образуют цветные комплексы с диэтил дитиокарбаматом натрия и другими соединениями.

Для разделения Л. используют методы тонкослойной хроматографии, часто с последующим анализом жирных к-т с помощью газожидкостной хроматографии (см. Хроматография).

Гистохимические методы определения в тканях

Самым старым методом окрашивания Л. в тканях является метод с использованием четырехокиси осмия (OsO₄). Этот реактив восстанавливается непредельными жирными к-тами и целым рядом других веществ, обладающих восстанавливающими свойствами. Продукты восстановления OsO₄ окрашены в черный цвет. Однако следует признать, что методы выявления Л. с помощью жирорастворимых красителей более просты и надежны. В гистохимии для этих целей прежде всего стали использовать судан III, несколько позже — судан IV и шарлах. Л. более интенсивно окрашиваются красящими смесями, особенно теми, которые содержат два (или более) гомолога или изомера нафтоловых суданов. Окрашивание Л. жирорастворимыми красителями основано на том, что они растворяются в жировых веществах лучше, чем в обычных растворителях. Термин «суданофилия» означает способность ткани окрашиваться любыми жирорастворимыми красителями.

Для сохранения Л. в тканях при фиксации рекомендуется использовать 10 — 15% р-р формалина, но еще лучше использовать фиксатор формол-кальций по Бейкеру: формалин— 10 мл; 10% хлористый кальций — 10 мл; дистиллированная вода — 80 мл.

К этому фиксатору должен быть добавлен мел, для того чтобы смесь имела нейтральную реакцию. Фиксировать ткань рекомендуется 24—48 час., более длительная фиксация может привести к образованию кристаллов, изменению растворимости Л. и т. д. Отмытая после фиксации ткань промывается в проточной воде; срезы готовятся на замораживающем микротоме. Ткань паренхиматозных органов можно предварительно заключить в желатину.

При окрашивании ткани на Л. дает хорошие результаты и одновременно выявляет суданофильную зернистость в сегментоядерных лейкоцитах метод Гольдмана. Р-р судана III для окраски тканей по этому методу готовится следующим образом: 70% этанол — 100 мл; дистиллированная вода —- 20 мл; альфа-нафтол — 1,2 г; судан III — в избытке.

Смесь кипятят в течение 10 мин. и фильтруют. Срезы ткани красят 15 мин., затем дифференцируют в 70% этаноле, контролируя процесс под микроскопом. Мазки крови фиксируют 3 мин. смесью, состоящей из 1 части формалина и 4 частей 96 % этанола.

При окраске тканей на Л. по методу Чаччо следует маленькие кусочки фиксировать в течение 24—48 час. в смеси следующего состава: 5% водный р-р двухромовокислого калия — 80 мл; формалин — 20 мл; ледяная уксусная к-та — 5 мл.

Затем кусочки ткани выдерживают 5 — 8 дней в 3% двухромовокислом калии («хромируют»), сутки промывают в проточной воде, проводят через этанол восходящих концентраций в течение суток, проводят через ксилол и заключают в парафин. Приготовленные срезы после обработки 70% этанолом красят насыщенным р-ром судана III в 70% этаноле или при температуре 50° красителем следующего состава: 80 % этанол — 95 мл; ацетон — 5 мл; судан III — до насыщения.

После охлаждения жидкость фильтруется. Срезы красят 30 — 60 мин. при температуре 30°, споласкивают 50% этанолом, промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатину.

Ядра клеток можно красить на Л. квасцовым гематоксилином, лучше это делать до обработки срезов су-даном. Л. окрашиваются в оранжевокрасный цвет.

Библиография: Алимова Е. К., Аствацатурьян А. Т. и Жаров Л. В. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний, М., 1975; Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, М., 1969; Кейтс М. Техника липидологии, пер. с англ., М., 1975; Комаров Ф. И., Коровкин Б. Ф. и Меньшиков В. В. Биохимические исследования в клинике, Л., 1976; Липиды, под ред. С. Е. Северина, М., 1977; Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники, с. 241, Л., 1969; П и р с Э. Гистохимия, пер., с англ., с, 259, М., 19 62; Lipids, ed. by R. Paoletti а. о., v. 1—2, N. Y., 1976; Masoro E. J. Physiological chemistry of lipids in mammals, Philadelphia, 1968; Searcy R. L. Lipopa-thies, Springfield, 1971.

Простые липиды

К простым липидам относятся триацилглицеролы (нейтральные жиры) и воска (см. Рис. 1).

1. Нейтральные жиры – это самые распространенные липиды, встречающиеся в природе. Их молекулы образуются в результате присоединения трех остатков высокомолекулярных жирных кислот к одной молекуле трехатомного спирта глицерина.

Среди соединений этой группы различают жиры, остающиеся твердыми при температуре 20 °С, и масла, которые в этих условиях становятся жидкими.

2. Воска – это сложные эфиры, образуемые жирными кислотами и многоатомными спиртами. Они покрывают кожу, шерсть, перья животных, смягчая их и защищая их от воды. Также из восков пчёлы строят соты.

Рис. 1. Простые липиды

Основные функции жиров в организме человека

Какие функции в организме выполняют жиры? Их множество — химические, физические, питательные, защитные и даже эстетические.

Липиды функции. Биологические функции липидов

1. Энергетическая. В количественном отношении липиды – основной энергетический резерв организма. Они содержатся в клетках в виде жировых капель, служащих «метаболическим топливом». Липиды окисляются в митохондриях до воды и диоксида углерода с образованием большого количества АТФ .

При полном окислении 1 г жиров до углекислого газа и воды выделяется около 39 кДж энергии, что намного больше по сравнению с полным окислением такого же количества углеводов. Это дает возможность животным, впадающим в спячку, расходовать накопленные летом и осенью жировые запасы для поддержания процессов жизнедеятельности в зимний период. Высокое содержание липидов в семенах растений обеспечивает энергией развитие зародыша и проростка, пока он не перейдет к самостоятельному питанию.

1. Структурная (строительная). Ряд липидов принимает участие в построении клеточных мембран. Типичными мембранными липидами являются фосфолипиды, гликолипиды и холестерин. Интересно, что мембраны совсем не содержат жиров.
2. Изолирующая (защитная). Жировые отложения в подкожной ткани и вокруг различных органов обладают высокими теплоизолирующими свойствами, благодаря тому, что жиры плохо проводят тепло. У синего кита толщина подкожного жирового слоя превышает 50 см, доходя до 1 м, поэтому он может жить в холодных водах.

Липиды предохраняют внутренние органы от механических повреждений (например, почки человека покрыты жировым слоем, защищающим их от травм, сотрясения при ходьбе и прыжках), так они выполняют роль амортизатора.

Как основной компонент клеточной мембраны липиды изолируют внутреннюю часть клетки от окружающей среды и за счёт гидрофобных свойств обеспечивают образование мембранных потенциалов.

Воск покрывает тонким слоем листья растений, не давая им намокать во время обильных дождей, препятствуя испарению воды в жарком климате.

У водоплавающих птиц и некоторых зверей воски выделяются специальными железами и служат смазкой для перьев и волос, придавая им водоотталкивающие свойства.

Миелиновые липиды в мембранах шванновских клеток образуют оболочку вокруг аксонов нейронов, за счёт этого мембрана поверхности нервной клетки электрически изолируется и импульсы по ней проходят намного быстрее.

1. Сигнальная (регуляторная). Стероиды, эйкозаноиды и некоторые метаболиты фосфолипидов выполняют сигнальные функции. Они служат в качестве гормонов, медиаторов и вторичных переносчиков (мессенжеров). Половые гормоны и кортикостероиды регулируют процессы развития и размножения, обмена веществ.

Витамины группы D, которые являются производными холестерина, играют важную роль в обмене кальция и фосфора. Другие витамины липидной природы: А, Е, К. Желчные кислоты участвуют в пищеварении: они обеспечивают эмульгирование жиров пищи и всасывание продуктов их расщепления.

1. Запасающая. Жиры служат источником энергии и воды в клетках. Они хранятся в жировых депо: капли жира внутри клетки, жировые тела насекомых, подкожная клетчатка. При окислении 100 г жиров выделяется 107 мл воды. Благодаря эндогенному образованию воды в пустыне могут жить многие животные, например песчанки и тушканчики. С этим связано накопление жира в горбах верблюда.

Развитие эмбрионов птиц и рептилий в яйце при запасе энергии и воды в виде жира, образуется в результате окисления из запасов в желтке. Киты не могут пить солёную воду, которой они окружены, и полагаются полностью на метаболическую воду.

1. Другие функции липидов. Отдельные липиды выполняют роль «якоря», удерживающего на мембране белки и другие соединения. Некоторые являются кофакторами, принимающими участие в ферментативных реакциях, например в свёртывании крови или в трансмембранном переносе электронов.

Светочувствительный каротиноид ретиналь играет центральную роль в процессе зрительного восприятия.

Жиры способствуют плавучести водных животных от мельчайших диатомовых водорослей, до китов.

Поскольку некоторые липиды не синтезируются в организме человека, они должны поступать с пищей в виде незаменимых жирных кислот и жирорастворимых витаминов. (рис.) Ненасыщенные жирные кислоты – арахидоновая, линолевая и линоленовая. Линолевая и линоленовая кислоты могут превращаться в арахидоновую за счёт наращивания цепи и, следовательно, являются её заменителями.

Классификация

Жиры являются сложными соединениями, которые могут встречаться в разных модификациях, они выполняют разные функции

Они представляют особую важность для клеток, принимают участие в многочисленных процессах человеческого организма. По этой причине классификация липидов достаточно обширная, она включает множество видов жиров, их основные признаки

Ниже в таблице имеется полная классификация жиров в зависимости от строения.

Описанные жиры относятся к омыляемым, во время их гидролиза получается мыло. Отдельно в группу неомыляемых жиров, а именно не вступающих в реакцию с водой, включают стероиды.

В зависимости от строения стероиды подразделяют на подгруппы:

• Стерины. Это стероидные спирты. Они содержатся в составе животных и растительных тканей (холестерин, эргостерин).
• Желчные кислоты. Производные холевой кислоты. Они содержат одну группу –СООН. Обеспечивают полноценное растворение холестерина и переваривание липидов. К этой группе можно отнести такие виды жирных кислот, как холевая, дезоксихолевая, литохолевая.
• Стероидные гормоны. Обеспечивают усиленный рост и развитие организма. К этой группе относятся гормоны – кортизол, тестостерон, кальцитриол.

Существует большая группа – липопротеины. Это сложные соединения жиров и белков (аполипопротеинов). Липопротеины относятся к сложным белкам, но не к жирам.

В их составе имеются разнообразные сложные эфиры:

• холестерины;
• фосфолипиды;
• нейтральные жиры;
• жирные кислоты.

Выделяют две группы липопротеинов:

• Растворимые. Содержатся в плазме крови, молоке, желтке.
• Нерастворимые. Имеются в составе плазмалеммы, оболочки нервных волокон, хлоропластов.

Жиры в зависимости от физической структуры разделяют на твердые, жиры, масла. По нахождению в организме выделяют резервные (непостоянные, зависят от питания) и структурные (генетические обусловленные) жиры. В соответствии с происхождением бывают животными и растительными.

ЛПНП (липопротеиды низкой плотности, бета-липопротеиды) — норма и отклонения

Биохимический анализ определения концентрации ЛПНП (липопротеидов низкой плотности, бета-липопротеидов) в крови — специфичный тест для оценивания риска патологических процессов в сердце и сосудах, назначения эффективного лечения этой проблемы.В кровяном русле человека циркулируют комплексы жиров и протеинов — липопротеиды, которые отличаются концентрацией в них жироподобного вещества, синтезированного печенью — холестерина. Различают:

• очень низкую плотность липопротеидов;
• альфа-липопротеиды (высокую плотность);
• бета-липопротеиды (низкую плотность).

Липопротеиды низкой плотности состоят из белковой оболочки (апопротеина — 25%), жирных кислот (триглицеридов — 10%), других жиров (липидов — 10%), холестерина (55%). Именно поэтому ЛПНП называют «плохим холестерином» и считают главным фактором, провоцирующим атеросклероз — патологию, поражающую крупные сосуды в результате накопления холестерина и образования «жировых бляшек».Холестерин является незаменимым компонентом клеточной оболочки (мембраны) и участвует в синтезе гормонов стероидной группы, витамина Д и желчных кислот

В артериальную систему человеческого организма холестерин поступает с липопротеидами низкой плотности, это и объясняет высокий риск развития заболевания атеросклероза и нарушения кровоснабжения сердечной мышцы (коронарной болезни) при повышении уровня этих липопротеидов.Для классификации гипер-липопротеидемии и проведения эффективного лечения этой патологии важное значение отводится биохимическому исследованию концентрации бета-липопротеидов.

Показания для проведения биохимического анализа

Исследование уровня липопротеидов низкой плотности входит в состав липидной панели, в которую включены тестирование общего холестерина, альфа-липопротеидов и триглицеридов.Опытные терапевты и кардиологи назначают проведение биохимического анализа для оценивания риска развития атеросклероза и ишемии пациентам при:

• повышенном артериальном давлении;
• сахарном диабете;
• заболеваниях печени;
• избыточной массе тела;
• злоупотреблении никотином и спиртными напитками;
• низкой физической активности;
• возрасте после 55 лет;
• перенесенном инсульте или инфаркте.

Методика проведения исследования уровня ЛПНП

Биохимический анализ проводится из плазмы без фибриногена, забор крови производят в лечебном учреждении из вены.Пациентам необходимо:1. За день до отбора крови ограничить физические нагрузки.2. Ужинать до 19 часов, запрещено спиртное и жирная пища.3. Утром нельзя пить кофе, сок и курить.За день до отбора крови ограничить физические нагрузки.Для определения уровня бета-липопротеидов используют прямую ферментативно-колориметрическую методику, основанную на взаимодействии искомого вещества со специфическими реагентами. Количество фракции определяет фотоколориметр.

Интерпретация результата анализа

Концентрацию ЛПНП в крови различают по следующим степеням:

• оптимальная: от 0,3 до 2,4 ммоль/л;
• близкая к оптимальной: от 2,5 до 3,1 ммоль/л;
• погранично высокой: от 3,2 до 3,9 ммоль/л;
• высокой: от 4,0 до 4,8 ммоль/л;
• очень высокой: более 4,8 ммоль/л.

Высокий уровень липопротеидов низкой плотности наблюдается при:

• гипотиреозе;
• почечной недостаточности;
• сахарном диабете;
• нервной анорексии;
• беременности;
• наследственной гипер-беталипопротеинемии;
• порфириновой патологии;
• дефекте иммунной системы — снижении уровня иммуноглобулинов.

Низкая концентрация бета-липопротеидов характерна для:

• гипертиреоза;
• стресса;
• хронической анемии;
• воспалительных заболеваний суставного аппарата;
• хронических болезней легких;
• тяжелых патологиях печени.

Повышению уровня ЛПНП способствует прием анаболических стероидов, кортикостероидов, андрогенов, а также длительное голодание и употребление продуктов, содержащих животные жиры.