Анализ ифа

Диагностика вирусов и бактерий картофеля методом ИФА

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный метод качественного и количественного определения разнообразных молекул, вирусов, бактерий и т.п. В основе метода лежит высокоспецифичная иммунологическая реакция антитела и антигена.

Антителами являются сложные белковые молекулы (иммуноглобулины), синтезируемые клетками иммунной системы человека и прочих теплокровных животных в ответ на проникновение в организм антигенов – вирусов, бактерий, молекул и прочих чужеродных объектов. Высокая специфичность взаимодействия между антителом и антигеном обусловлена тем, что активный центр антитела способен связываться с уникальным фрагментом антигена.  Именно это свойство реакции антитело-антиген определяет специфичность, надёжность, достоверность и чувствительность ИФА при проведении диагностики патогенов картофеля. При наличии целевого патогена в исследуемом образце формируется комплекс соответствующих антител и антигена, детекцию которого определяют по активности фермента, связанного с антителами.

Существует широкое разнообразие методов  проведения ИФА, различающихся природой антигена, принципом связывания, условиями проведения, способами детекции результатов ферментативной реакции и т.п. Для диагностики патогенов сельскохозяйственных культур традиционно используется “сэндвич”-метод с использованием двух типов антител (DAS-ELISA – double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). В качестве фермента, обычно, используется щелочная фосфатаза.

Проведение иммуноферментного анализа

Реакция проводится в 96-луночных полистирольных микропланшетах, характеризующихся высокой эффективностью связывания белковых молекул, в т.ч. иммуноглобулинов (антител), на своей поверхности.

На первом этапе антитела захвата (capture antobodies) разводят в необходимой концентрации в покровном буфере (coating buffer), вносят в лунки микропланшетов и инкубируют от нескольких часов при температуре +30-37°С до нескольких дней при температуре +4°С. Во время инкубирования антитела неспецифически адсорбируются на поверхности лунок микропланшета. По окончании инкубирования планшеты промывают несколько раз промывочным буфером (wash buffer) для удаления антител захвата, которые не связались с поверхностью микропланшета.

Сорбция антител захвата на поверхности лунки микропланшета

На следующем этапе в лунки микропланшета, поверхность которых покрыта антителами захвата, вносят сок, экстракт, или гомогенат растений, исследуемых на наличие антигенов – патогенных бактерий или вирусов и инкубируют 14-16 часов  при температуре +4°С. При необходимости, растительный материал можно развести экстракционным буфером (extraction buffer). По окончании инкубирования лунки несколько раз промывают промывочным буфером.

При наличии целевого патогена в образце происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антигенсвязывающим центром антител захвата.

Связывание антигена с антителами захвата

В промытые лунки наносят антитела детекции, конъюгированные с ферментом щелочная фосфатаза (Ф). Антитела разводят в необходимой концентрации в конъюгатном буфере (conugation buffer). Микропланшеты инкубируют при температуре +30°С в течение 5 часов. По окончании инкубирования микропланшеты несколько раз промывают промывочным буфером для удаления антител детекции, не связавшихся с антигенами.

На данном этапе происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антиегнсвязывающим центром антител детекции. Антигенсвязывающие центры антител захвата и антител детекции различны и специфично связываются с разными фрагментами антигена.

Связывание антител детекции с антигеном

На заключительном этапе в лунки добавляют пара-нитрофенилфосфат, являющийся субстратом для фермента щелочная фосфатаза. При наличии в растительном образце целевых патогенов формируется комплекс антитело захвата-антиген (вирус или бактерия)-антитело детекции, конъюгированное с ферментом щелочная фосфатаза. Фермент (Ф) катализирует превращение бесцветного пара-нитрофенилфосфата (субстрат, С) в жёлтый пара-нитрофенол (продукт, П), в результате чего происходит окрашивание реакционной смеси в жёлтый цвет. Интенсивность окраски  реакционной смеси можно оценивать как визуально, так и с помощью спектрофотометра.

Фермент, конъюгированный с антителами детекции, катализирует реакцию превращения бесцветного субстрата в жёлтый продукт

Анализ и его результаты

Для лабораторной диагностики сифилиса методом иммуноферментного анализа используется венозная кровь пациента.

Исследование назначается  при:

• беременности во время постановки женщины на учет к акушеру-гинекологу;
• явных симптомах, в частности язвочки, узелка, трещинки на половых органах, в ротовой полости, анальной ;
• лечении других ЗППП (гонореи, хламидиоза и т.д.);
• неспецифических признаках для исключения сифилиса.

Венозную кровь на сифилис сдают также для оценки эффективности лечения. Исследование в таком случае проводится через 3, 6, 12, 24 месяца с момента его начала.

Результат анализа может быть положительным или отрицательным, а при наличии антител определять стадию развития болезни.

Цена анализа ИФА на сифилис – 1000 руб. Свяжитесь c нами любым удобным способом и запишитесь на прием на конкретную дату и время. Подробный прайс

Обращайтесь! Мы сможем вам помочь!

• Сифилис. Описание заболевания
• Симптомы сифилиса
• Пути заражения сифилисом
• Возможные осложнения
• Экспресс-анализ на сифилис
• Лечение сифилиса

Выработка IgM и IgG при сифилисе

Проникновение любого патогенного микроорганизма сопровождается соответствующей реакцией иммунной системы. Так, при заражении бледной трепонемой иммунитет начинает вырабатывать специфические антитела. Первыми синтезируются антитела IgM. Обнаружить их в крови можно у большинства пациентов к концу второй недели развития болезни. Выработка IgM сопровождает течение первой и второй стадии сифилиса.

Примерно через 3-4 недели с момента инфицирования в крови появляются иммуноглобулины класса G. Их содержание растет постепенно. Но уже к шестой недели течения болезни концентрация IgG становится выше, чем число определяемых иммуноглобулинов класса М. после того, как содержание IgG достигает своего максимума, в течение длительного времени оно остается примерно на одном уровне.

Благодаря иммунному ответу организма на заражение ИФА анализ крови на сифилис уже с 2-3 недели после инфицирования помогает с точностью определить наличие болезни.

Экспресс анализы за 20 минут и тест-системы определят состояние Вашего здоровья! или по телефону 8 (495) 970-30-92

Иммуноферментный анализ крови: основные понятия

Прежде чем разбираться в сути метода ИФА, дадим краткое объяснение некоторых понятий.

Иммуноглобулины

Антителами или иммуноглобулинами (Ig) называют специфические белки, которые вырабатывают B-лимфоциты (иммунные клетки) в ответной реакции на проникновение в организм каких-либо инфекционных патогенов (вирусов, бактерий, грибов и др.).

Иммуноглобулины делят на классы IgA, IgE, IgM, IgG и IgD. Их различия состоят в разной молекулярной форме и массе, разном периоде полураспада, участии или неучастии в инфекционном процессе, разных сроках их выявления после инфицирования. Самую большую молекулярную массу имеет иммуноглобулин IgM (950 000 Да). Для сравнения, у остальных она находится в границах 150 — 200 000 Да.

Из-за своей большой массы IgM просто не в состоянии преодолевать плацентарный барьер. Поэтому, если у ребенка на 1-ом году жизни обнаружен IgM, то это однозначный признак инфицирования плода.

В сыворотке крови наибольшая доля иммуноглобулинов приходится на IgG (75-85%), а наименьшая – на IgE (0,003%). В инфекционный процесс непосредственно вовлекаются только иммуноглобулины A, M, G. Наличие иммуноглобулина IgE является реакцией на аллергические заболевания. IgD формирует местный иммунитет, а обнаружить его можно только в тканях лимфоузлов и миндалин.

Антигены

Антигены представляют собой чужеродные высокомолекулярные вещества с органическим происхождением. В частности, это могут быть возбудители инфекционных и иных заболеваний, а также различные вещества клеток, измененных в результате того или иного заболевания (аутоиммунного или онкологического).

Антигены вызывают защитную реакцию организма – выработку иммуноглобулинов.

Иммунный комплекс

Иммунным комплексом называют соединение антиген-антитело, которое участвует в иммунном процессе.

В основе метода ИФА лежит образование иммунного комплекса в результате иммунной реакции антигена и антитела и последующего изменения ферментативной деятельности специальных меток на антителах.

Существует несколько видов иммуноферментного анализа (непрямой, прямой, одновременный, метод блокирования). На практике чаще отдают предпочтение гетерогенному твердофазному иммунному анализу (ELISA).   

Кому следует сдать тест на ВИЧ

Заразиться ВИЧ может любой человек. Вирус передается с кровью, спермой, выделениями из половых органов, грудным молоком. Он содержится в слюне, но в очень небольшой концентрации — такой, что заразиться при поцелуях или через общую посуду невозможно. Передача вируса может происходить:

• при незащищенном проникающем сексе,
• при использовании нестерильных игл, шприцев,
• при переливании крови или ее компонентов,
• ребенку от матери во время беременности или при грудном вскармливании.

Долгое время после заражения у ВИЧ нет никаких симптомов, поэтому важно проходить тестирование, даже если признаки болезни отсутствуют. Инфекция угнетает работу иммунной системы, и ее симптомы появляются при развитии синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД)

Среди признаков:

• быстрая и большая потеря веса,
• ощущение бессилия, усталости,
• повышенная температура,
• потливость по ночам,
• диарея,
• увеличение лимфатических узлов,
• появление сухого кашля, не связанного с бронхитом, пневмонией или курением.

Для некоторых людей риск заразиться ВИЧ является более высоким. В группе риска:

• те, у кого был незащищенный половой контакт,
• те, кто часто меняет половых партнеров,
• люди, употребляющие наркотики с использованием шприцев и игл,
• имеющие гомосексуальные контакты мужчины,
• люди некоторых профессий: медики, спасатели, полицейские, тюремные служащие и другие работники, для которых высока вероятность контакта с зараженной кровью и другими потенциально опасными биологическими жидкостями.

Важно! Есть ситуации, когда тестирование на ВИЧ следует сделать, даже если потенциальный риск заражения отсутствует: перед хирургическими вмешательствами, сдачей донорской крови, при планировании беременности

Что происходит в организме после заражения

Сифилис принадлежит к категории венерических заболеваний. В его течении выделают три стадии, характеризующиеся развитием первичной, вторичной и третичной формы патологии. Болезнь поражает кожу, слизистые оболочки, внутренние органы и ткани, нервную систему, опорно-двигательный аппарат. По статистике, третичный сифилис развивается примерно у 30% заболевших. 25% пациентов на фоне осложнений умирают. Именно поэтому своевременная диагностика посредством ИФА на сифилис и других исследований является жизненно необходимой.

Для определения инфекционного заболевания на разных стадиях используются прямые и непрямые (косвенные) методы лабораторной диагностики. Первые направлены на обнаружение бледной трепонемы и ее ДНК, вторые – на выявление специфических антител, которые организм вырабатывает для борьбы с возбудителем. Косвенные методы в свою очередь делятся на:

• нетрепонемные (антикардиолипиновый тест, реакция микропреципитации);
• трепонемные (иммунолюминесцентный и иммуноферментный анализ, иммуноблотинг, реакция пассивной гемагглютинации и иммунофлуоресценции).

Исследование методом ИФА является трепонемным тестом. С его помощью специалисты определяют наличие и количество специфических белков IgM и IgG.