Методы исследований в микробиологии

Способы диагностики

Основные методы исследования:

1. Прямой метод — бактериоскопическое/бактериологическое исследование для поиска возбудителя.
2. Косвенный — серологические исследования позволяют выявить антигены в инфицированных материалах или найти антитела в секретах и кровяной сыворотке, взятых из организма пациента. Серологическая проверка служит для уточнения клинического диагноза, подтверждения роли условно-патогенных бактерий в протекающем инфекционном заболевании. Они имеют вспомогательное значение, но не заменяют бактериологические. 
3. Комплекс микробиологических исследований необходим для конкретизации синдромологического клинического диагноза, точнее поможет установить причину заболеваний полиэтиологической природы. Играют важную роль в диагностировании инфекционных болезней, при целенаправленном выборе терапевтических средств. 

Бактериоскопическое исследование основано на микроскопическом изучении материала, производится при разнообразных инфекционных болезнях для выявления в крови возбудителей. На присутствие бактерий проверяются различные материалы. Спинномозговую жидкость берут при туберкулёзном менингите; при дифтерии, ангине используют слизь из носоглотки; при амебиазе, лямблиозе, дисбактериозе кишечника проводится анализ кала; при лептоспирозе — анализ мочи. Бактериоскопический анализ проводится быстро, результаты готовы через несколько часов. 

Бактериологическая диагностика позволяет в короткие сроки обнаружить микробы и выяснить, какое количество бактерий есть во взятом для анализа материале. Материал, требуемый для анализа, собирают и упаковывают в стерильную посуду с соблюдением всех правил асептики, доставляют в лабораторию в самые кратчайшие сроки. Пробы недолго можно хранить на холоде. 

Вовремя проведённое бактериологическое исследование (в самом начале болезни) даёт высокий положительный результат. Данные анализов лаборатория выдаёт через два-четыре дня, при таких заболеваниях как туберкулёз, бруцеллёз — спустя три-четыре недели, в зависимости от сроков роста анализируемых микроорганизмов для их последующей идентификации. Верная оценка результатов зависит от многих факторов: как правильно взяты биологические материалы, вовремя ли они предоставлены для анализа и т.п. 

Сейчас существуют более ускоренные методы для выявления бактерий. Индикаторы СИБ (индикаторные бумажки) позволяют через 6-10 часов выделить чистейшую бактериальную культуру, которая не требует каких-то особых питательных сред. 

Выбор методов бактериологического исследования и материалов для проведения анализов напрямую зависят от цели проводимого анализа, патогенеза, протекания болезни. 
Вы всегда можете воспользоваться услугами нашей поликлиники: мы проведём бактериологическое исследование и предоставим достоверные результаты! 

Определение свойств микроорганизмов

Бактериологические (культуральные) исследования микроаргонизма включают несколько методов, которые делят на:

• микроскопию мазков изучаемых материалов;
• выделяют чистую культуру, для дальнейшего изучения важнейших характеристик – морфологического, культурально-биохимического, антигенного, патогенетического плана.

По результатам испытаний, специалисты производят сопоставление сведений с теми признаками, которые представлены классификационными справочниками (определителями) идентификации бактерий. После чего проводится родовая, наряду с видовой дифференциацией. Для разрешения спорных и сомнительных ситуаций, необходимо повторно исследовать идентификационный материал.

Отчет содержит исчерпывающую информацию относительно выделенного микроба. Если предстоит поставить диагноз на наличие инфекционного заболевания, в расчет принимают эпизоотологические, клинические, патологоанатомические данные.

Особенности физиологии и биохимической активности

Данные отрасли направлены на изучение:

• жизнедеятельности;
• процессов метаболизма;
• вопросов, связанных с питанием, возможностью получать энергию для роста и размножения;
• особенностей взаимодействия бактерий с окружающими факторами.

Понимание процессов метаболизма помогает разработать методики культивирования, с последующей идентификацией и получением чистых культур.

Не менее важно выяснить физиологические свойства, что облегчает последующее понимание патогенеза инфекционных заболеваний, вызванных ими. Обязательной становится процедура постановки микробиологического диагностирования, проведение правильно подобранного лечения

Также это одно из основных условий разработки мер по своевременной профилактике и недопущению распространения болезней.

Еще одним направлением выступает возможность грамотно отрегулировать взаимоотношения людей и окружающей среды. Широкое распространение получил метод, который основан и на использовании микроорганизмов в проведении биотехнологических процессов, на предмет создания БАВ.

Не стоит даже упоминать, что подобные изыскания должны проходить под неусыпным контролем со стороны профессионалов, при соблюдении обязательных условий.

Методика определения чувствительности возбудителей к антибиотикам

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (антибиотикограмма) анализ урины на посев проводится по следующему алгоритму:

• Деление чаши Петри на несколько секторов и помещение в каждый из них полоски с антибиотиком.
• Маркировка цветом каждого участка и засев выделенной культурой.
• Помещение чаши в термостат с температурой 36,6.
• Ведение ежедневного контроля. Отсутствие роста и размножения бактерий означает, что антибиотик их подавляет, а значит подобран верно.  

В противном случае возбудитель устойчив к действию данного антибиотика, и его нужно заменить.

Антибиотикограмма проводится только при обнаружении бактерий более, чем 104 КОЕ/мл. Длительность такого анализа составляет 4-5 дней. Современные экспресс-методики позволяют получить результат уже через 2 дня. В экстренных случаях, когда результат необходим для лечения тяжелобольного пациента, предварительные данные могут быть предоставлены уже спустя 4 часа.

Резистентность микробов к факторам окружающей среды

Огромное влияние на важнейшие характеристики жизнедеятельности бактерий выявляют такие показатели, как:

• температура;
• излучение УФ;
• влажность.

Большинство из них отличается высокой степенью устойчивости к воздействию даже очень низких температур – до -90С. Споры более чувствительны и могут погибнуть уже при -53С. Высокие оказывают разрушающее действие: не образующие спор умирают при +60С, остальные достаточно прогреть чуть выше +100С.

Совершенно по-разному реагируют микробы на высушивание: если одни разрушаются практически мгновенно, то другие сохраняют жизнеспособность десятки лет. Это споры бацилл сибирской язвы, что значительно усложняет при погашении эпидемий сложившуюся в конкретном регионе, ситуацию.

Особой чувствительностью бактерии обладают к прямым солнечным лучам, ультрафиолету.

Существуют специально отработанные методические указания идентификации микроорганизмов, где четко прописаны все факторы, оказывающие непосредственное влияние на различные виды микроорганизмов, что значительно упрощает процедуру проведения испытаний. Однако, независимо от такой поддержки, совершенно обязательным становится выполнение всех работ в условиях специализированных лабораторий, под контролем профессиональных исполнителей

Важно наличие у экспертов соответствующего образования, практического опыта, знаний

Бактериальный состав микрофлоры кишечника

Все микроорганизмы, которые населяют полость кишечника, медики для удобства классифицируют по тому, могут ли они представлять для своего носителя какую-либо опасность в определённых условиях.

Таким образом, выделяют:

• здоровые бактерии, которые функционируют в кишечнике, и не причиняют носителю вреда: лактобактерии, бифидобактерии, эшерихии;
• условно-патогенные микроорганизмы, которые могут провоцировать развитие некоторых патологических процессов при определённых условиях: клостридии, стафилококки, кандиды, энтерококки;
• патогенные, которые являются возбудителями опасных заболеваний: сальмонеллы, шигеллы.

РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ ДОКУМЕНТЫ

• СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гиги
• СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»
• СанПиН 2.1.4.2496-09 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. Гигиенические требования к обеспечению безопасности систем горячего водоснабжения»
• СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников»
• СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод»
• ГН 2.1.5.1315-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового пользования»
• ГН 2.1.5.2280-07 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования». Дополнения и изменения №2 к ГН 2.1.5.1315-03
• Приказ Федерального агентства по рыболовству от 18.01.2010 г. №20 «Об утверждении нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения…»

Сбор биоматериала

Мокрота на посев собирается утром до первого приема пищи в специальный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Для того, чтобы в биоматериал не попали примеси слюны и слизи, перед сбором образца для исследования проводится тщательное очищение ротовой полости и носоглотки.

Анализу подлежит только свежая мокрота, выделенная в результате продолжительного откашливания.

Сбор мокроты на посев с определением чувствительности к антибиотикам проводят до начала лечения антибактериальными препаратами. В противном случае полученный результат может быть ложноотрицательным.

Расшифровка результатов бакпосева мочи: норма и патология

Результат анализов выводится в КОЕ на 1 мл мочи. КОЕ (колониеобразующие единицы) – это абсолютное значение, показывающее количество клеток бактерий в 1 мл урины.

Лаборатория выдаст распечатку результатов, в которой будут указаны все виды микроорганизмов, их количество, измеренное в КОЕ/мл, и антибиотикограмма – группы препаратов, к которым чувствителен каждый вид бактерий.

Результат бакпосева не всегда однозначно положительный или отрицательный. Он имеет референсные значения, которые указывают на степень воспаления.

На бланке антибиотикограммы проставляются значки:

Для чего необходимо бактериологическое исследование?

Бактериологические исследования позволяют идентифицировать возбудителя болезни и установить его степень чувствительности к определенным антибиотикам для выявления эффективности лечения. Данный метод исследования широко применяется в медицинской практике инфекционистами, отоларингологами, гинекологами, урологами, онкологами, хирургами и другими специалистами. Он назначается при любых воспалительных заболеваниях в организме и при подозрении на развитие сепсиса.

Как правильно осуществить забор материала?

Материалом для бактериологических исследований может служить кровь, ликвор, мокрота, испражнения, моча, желчь, спинномозговая жидкость, грудное молоко, выделения из ротовой полости, половых органов, зева, носоглотки и ран.

Главное требование забора – стерильность посуды и инструментов. При несоблюдении этого требования результаты окажутся совершенно неправильными, так как произойдет обсеменение собранного материала.
Брать биологический материал для исследований следует до начала приема антибиотиков. В противном случае результат существенно исказится.
Полученный материал необходимо немедленно доставить в лабораторию, чтобы не допустить его гибели.
В нашей лаборатории забор биологических жидкостей выполняется в абсолютно стерильных условиях специально обученными медсестрами в соответствии со всеми правилами, что гарантирует качество собранного материала и достоверность полученных результатов.

Как проходит исследование?

Бактериологические исследования включают несколько этапов, на проведение которых требуется от 3 до 10 дней.
Чтобы выделить чистую культуру возбудителя, осуществляют посев полученного материала на специальную питательную среду, на которой способен жить только определенный вид микроорганизмов. Например, для идентификации дифтерийной палочки применяют теллуритовую среду, а для обнаружения кишечной палочки – среду Эндо. Если требуется выделить условно-патогенные микроорганизмы, то пользуются универсальными питательными средами, чаще всего кровяным агаром.

Питательную среду помещают в термостат, чтобы создать оптимальные условия для роста и размножения микроорганизмов.
По истечении определенного времени производят контрольный осмотр полученных колоний

Если необходимо, используют специальные красители, позволяющие обнаружить определенные штаммы бактерий. 
При контрольном осмотре обращают внимание на цвет, форму и плотность колонии, ее способность к разложению некоторых органических и неорганических соединений. Затем с помощью специальных методов подсчитывают количество микроорганизмов в образце.

Плюсы и минусы бактериологического исследования

Бактериологический посев имеет несколько преимуществ:

• характеризуется высокой специфичностью;
• позволяет проводить исследование любой биологической жидкости;
• дает возможность определить чувствительность патогенного микроорганизма к определенному лекарству и правильно подобрать терапию.

Но есть у этого метода и некоторые недостатки:

• результат можно получить только по происшествии нескольких дней;
• требует высокой квалификации персонала бактериологической лаборатории;
• предъявляет высокие требования к забору материала.  

Результат исследования

Результатом бактериологического исследования является обнаружение возбудителя (или его отсутствие) в собранном материале и выявление его концентрации, что позволяет подобрать результативную терапию и эффективно избавиться от возбудителей.

Материал для исследования

Инфекционные процессы сопровождаются увеличением количества бактерий в очаге воспаления. Поэтому забор на бактериологическое исследование собирают в месте наибольшей концентрации микроорганизмов. В зависимости от того, подозрения на какую болезнь необходимо выяснить, берут биоматериал:

• анализы мочи,
• крови,
• кала,
• ликвора,
• мокроты из зева и носа,
• спермы у мужчин,
• грудного молока,
• раневого отделяемого и т.д.

К примеру, диагностика туберкулеза проводится с помощью анализа мокроты. Забор мочи производится при подозрении на воспалительный процесс в почках, ангинах, бронхитах.

Подготовка к бактериологическому исследованию

Основные принципы подготовки к сдаче анализа зависят от того, для чего проводится бактериологическая лабораторная диагностика. Какие соблюдаются правила при заборе материала, объясняет лечащий врач в клинике «Бионика».

Общие рекомендации, для всех видов исследования:

1. Минимум за 24 часа, а лучше за 2-3 дня до сдачи биоматериала, надо отказаться от употребления алкогольных напитков, жирной, острой и соленой пищи.
2. Не принимать никакие лекарственные препараты, в том числе витамины и БАДы. О тех, которые необходимы – уведомить лечащего врача,

Преимущества исследования

Главным преимуществом бактериологического исследования является специфичность и чувствительность. Это позволяет обнаруживать микроорганизмы, даже в незначительной концентрации.

С помощью микроскопов и специального оборудования, устанавливают свойства выделенных микроорганизмов. Это дает возможность подобрать наиболее эффективную терапию – лекарственные препараты или внутримышечные инъекции антибиотиков, бактериофаги или антимикотические препараты.

Проведение исследования

Бактериологические методы исследования по точности определению отстают от иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР), однако в отличие от анализов с применением высоких технологий и высокой точности, определяют степень чувствительности выделенных штаммов бактерий к группам антибиотиков. Полученный результат позволяет подобрать максимально эффективное лечение и скорректировать дозы лекарств. В современных лабораториях в Красноярске проведение бактериологического исследования занимает около 2-3 суток. После сбора биоматериала, производится его посев на питательные среды. Затем определяются выделенные культуры. Полученные данные анализируются для определения эффективности разных видов терапии.

Расшифровка результатов

Биоценоз кишечника разделяют на 2 группы:

• облигатнаямикрофлора (Bifidobacterium, Lactobacillus, E. coli);
• факультативнаямикрофлора (Streptococcus, Clostridium, Staphylococcus, грибы Candida).

Облигатная флора – постоянные обитатели кишечника, способствующие нормальной его работе, препятствуют размножению условно-патогенных и патогенных микробов. Факультативная – составляет до 4% микробиоты, является условно-патогенной. Патогенные бактерии (сальмонеллы, шигеллы), которые попадают в организм извне, являются причиной серьезных инфекционных болезней.

Для расшифровки результатов бактериологического посева кала важно знать нормы показателей кишечной микробиоты. Также следует помнить, что ее состав зависит от возраста пациентов.. Бифидобактерии – самая многочисленная составляющая кишечной флоры (90-98%)

Они основные «защитники» организма:

Бифидобактерии – самая многочисленная составляющая кишечной флоры (90-98%). Они основные «защитники» организма:

• стимулируют иммунитет;
• препятствуют размножению патогенных микробов;
• вырабатывают витамины (В и К).

Нормальные показатели: 108 -1011 КОЕ/г.

Лактобактерии поддерживают нормальный pH кишечника, вырабатывают вещества, направленные на борьбу с патогенами. В фекалиях они содержатся количестве 106-108 КОЕ/г.

E. coli (кишечная палочка) участвует в расщеплении сахаров, помогает в выработке витаминов группы В, участвует в стимуляции иммунитета, вырабатывает антибиотикоподобные субстанции.

Количество типичной кишечной палочки колеблется в пределах 107-108 КОЕ/г. Гемолитические E. coli в норме отсутствуют.

Бактероиды – анаэробные бактерии. Присутствуют в количестве 107-1011 КОЕ/г.

Количество микроорганизмов облигатной флоры снижается при:

• несбалансированном питании;
• приеме антибактериальных препаратов;
• инфекционных болезнях;
• хронических энтероколитах;
• иммунодефиците.

Представители факультативной микрофлоры создают благоприятные условия для сахаролитических бактерий, активизируют иммунную систему. Однако их количество в здоровом организме ограничено, потому что при активном росте они способствуют возникновению ряда заболеваний.

Количественные показатели основных представителей этой части биоценоза (Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella, Proteus, Morganella, род Acinetobacter, род Pseudomonas, грибы Candida, клостридии) не должны превышать 104 КОЕ/г. Исключение составляют энтерококки, фузобактерии, пептострептококки. В норме их может быть до 108-109 КОЕ/г.

Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк) – должен отсутствовать в образцах кала.

К патогенным микроорганизмам относят шигеллы и сальмонеллы – в кишечнике не должно быть патогенной флоры.

Сальмонелла – вызывает острую токсикоинфекцию. Заражение происходит, если съесть мясо или яйца, которые не прошли должную термическую обработку, или выпить зараженную воду.

Шигелла – является причиной дизентерии. Пути заражения:

• через грязную воду;
• продукты (молоко, овощи);
• контакт с заболевшими и зараженными предметами обихода.

Оценку результатов бактериологического исследования кала обязательно должен проводить врач.

Какие патологии выявляет бактериологический анализ мочи

Бакпосев на патогенную флору поможет диагностировать такие заболевания, как:

• хронический уретрит;
• рецидивирующий цистит;
• пиелонефрит;
• паранефрит.

Бактериологический анализ мочи выявляет следующие инфекции в зависимости от возбудителя:

• Стафилококки и стрептококки. Выявляет все виды патогенных микроорганизмов, опасных при беременности для ребёнка;
• Хламидии. Патогенные микроорганизмы в урине подтверждают сомнительный диагноз;
• Гонорею. Назначается пациенту, если его партнёр — носитель вируса;
• Бациллу Коха. Степень бактериурии определяет наличие туберкулёза и насколько поражены почки и мочевыводящие пути при таком заболевании;
• Протеи. Протейная инфекция вызывает воспаление почек и мочевыводящих путей, может привести к острому пиелонефриту;
• Энтерококки. Эти кишечные бактерии могут быть губительными для мочевыводящей системы;
• Синегнойную палочку. Эта бактерия является причиной циститов, уретритов и пиелонефритов;
• Коклюш. Анализ выявит болезнь даже на ранней стадии и при начальных
• симптомах;
• Клебсиеллы. Опасная бактерия, устойчивая к большинству антибиотиков. Вызывает воспалительные заболевания мочевыводящих путей и может привести к различным тяжёлым последствиям;
• Дизентерийные соединения. Способен выявить сальмонеллез и дизентерию у пациентов любого возраста.

Подготовка к процедуре и сбор мочи на посев

Для получения реальной картины состояния внутренней микрофлоры крайне важно соблюсти все требования относительно подготовки и сбора мочи:

забор материала осуществлять до начала антибиотикотерапии;
за неделю до анализа отказаться от употребления в пищу красящих овощей (морковь, свекла), алкоголя, жирной, солёной и копчёной пищи;

женщинам нельзя сдавать мочу на посев во время месячных, за неделю до них и после;

накануне запрещается проводить спринцевание;
за 2 суток остановить приём мочегонных средств (как народной, так и традиционной медицины), лекарственных и противозачаточных средств в форме вагинальных свечей;
за сутки до сбора мочи избегать половой близости;
накануне не употреблять много жидкости, чтобы не снизить количество бактерий в выделениях;
снизить физические нагрузки во избегание возможного изменения состава мочи;
использовать стерильную сухую ёмкость. Оптимальный вариант – пластиковый стаканчик с крышкой (продаётся в аптеке), поскольку тару, хранящуюся дома, достаточно трудно качественно простерилизовать. Для грудных деток рекомендуется использовать стерильный пакет или одноразовый мочеприёмник;
нельзя собирать мочу из судна или мочеприёмника;
применение катетера допускается лишь в крайних случаях;
открывать контейнер необходимо только чистыми руками непосредственно перед сбором материала, не касаться внутренней стороны и края тары;
перед сбором материала нужно провести тщательную гигиену половых органов (средства не должны содержать антисептик), затем насухо вытереть;
осуществлять сбор средней порции утреней мочи, т.е. первую и конечную струю спустить в унитаз;
при подозрении на нефротуберкулёз сбор материала нужно проводить 3 раза в день в течение 3 дней;
женщинам необходимо прикрыть вход во влагалище (например, тампоном), чтобы слизь из него не попала в мочу

Это важно, поскольку она также содержит различные бактерии;
количество урины, необходимой для анализа, составляет 20-50 мл, для детей достаточным считается 10 мл;
собранный материал в течение 2 часов доставить в лабораторию (хранить в тёмном прохладном месте). При необходимости допускается 8-часовая выдержка в холодильнике.